一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合精子的方法，属精子鉴定方法，将FITC粉末中加入DMSO配置FITC浓储液，将MITO粉末中加入DMSO配置MITO浓储液，HEPES、氯化镁、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、丙酮酸钠、葡萄糖、乳酸钠、牛血清白蛋白和超纯水配置stainingtalp精子染色缓冲液，精子FITC染色、MITO染色，将用FITC染色后的精子与用MITO染色后的精子等量混合，FITC、MITO染色后和FITC染色与MITO染色后的精子等量混合后3h荧光检测。本发明的有益效果是：在不影响精子活力的条件下，只通过两种荧光染光可将形态相近的精子在一定时间内区分出来。