本发明涉及一种羊X/Y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用。本发明提供了一种羊X/Y精子分离冷冻精液，包括冷冻平衡液A，含12％甘油冷冻保护剂冷冻平衡液B和羊X或Y精子分离冷冻精液。本发明应用羊X、Y精子DNA含量的差异，通过流式细胞方式分离X和Y精子，然后制成性别控制冷冻精液，其冷冻保存条件为-90--120℃处理20-30分钟。本发明得到的冷冻精液用于以人工授精方式或胚胎移植方式控制羊产羔的性别，分离效率高，性别控制准确率可达90％以上，适用于产业化生产和养殖，从而大幅度提高养殖效应。